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| NR4A1基因的克隆及真核表达载体的构建 |
| 王良国，黄晓燕，林素，潘嘉林，戴晓春，王本极，吴漪浩，杨德业 |
| 温州医学院附属第一医院心内科,温州医学院 心血管生物和基因研究所,浙江 温州 325000 |
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| Cloning of the mouse NR4A1 gene and construction of its eukaryotic expression vector |
| 引用本文: |
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王良国,黄晓燕,林素,等. NR4A1基因的克隆及真核表达载体的构建[J]. 温州医科大学学报, 2013, 43(4): 232-236.
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| Cite this article: |
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摘要 目的:克隆小鼠孤儿核受体(NR4A1)基因全长cDNA的读码框,构建携带NR4A1基因的重组真核表达载体,为研究其在心肌细胞中的功能做准备.方法:从Pax-8敲除的小鼠心肌组织中提取总RNA,通过逆转录得到总cDNA,利用逆转录PCR法扩增,将目的产物与pGEM-T Easy载体连接,测序分析正确后,再以相同PCR方法扩增,将其与真核表达载体pIERS2-ZsGreenl连接,构建重组质粒.经限制性酶切及测序鉴定后,利用Lipofectamine2000将重组载体pIERS2-ZsGreenl-NR4A1转染到H9C2心肌细胞.实验分三组:①实验组(PZ-NR4A1组):细胞转染1.2 μg pIERS2-ZsGreenl-NR4A1重组载体；②阴性对照组(NC组):细胞转染1.2 μg pIERS2-ZsGreenl空载体；③空白对照组(BC组):给予的常规培养液,未做其他处理.并用RT-PCR法和Western blotting法检测转染后NR4A1 mRNA和蛋白的表达.结果:成功构建了小鼠pIERS2-ZsGreen1-NR4A1真核表达载体.转染重组载体到细胞后,相比BC组(1.00±0.00)和NC组(0.99±0.16),PZ-NR4A1组(2.62±0.21) NR4A1 mRNA表达水平明显升高(P＜ 0.05),而BC组和NC组mRNA表达水平差异无统计学意义(P＞ 0.05).PZ-NR4A1组(0.72±0.11)NR4A1蛋白的表达量与BC组(0.17±0.07)和NC组(0.21±0.08)相比,PZ-NR4A1组蛋白表达量明显升高(P＜0.05),而BC组和NC组蛋白表达量差异无统计学意义(P＞0.05).结论:通过基因重组技术,成功克隆了NR4A1基因,并构建了真核表达载体pIERS2-ZsGreenl-NR4A1,且能够在H9C2心肌细胞中获得有效过表达,这为进一步探讨NR4A1基因的生物学功能及机制奠定了基础。
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| 基金资助:浙江省自然科学基金资助项目 温州市科技局科研基金资助项目 |
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